Badania związków fenolowych w wybranych gatunkach szałwii (Salvia sp.) metodami chromatograficznymi HPLC i TLC

Abstract

1. Za najefektywniejszą metodę ekstrakcji uznano tę, w której materiał roślinny najpierw ekstrahowano n-heksanem, a następnie metanolem, techniką ciśnieniowej ekstrakcji cieczowej (ASE). 2. Technika jednokierunkowej, izokratycznej chromatografii cienkowarstwowej jest niewystarczająca w przypadku analizy porównawczej złożonych próbek zawierających związki o różnej polamości. 3. Na podstawie binarnych fmgerprintów HPTLC stwierdzono, iż profil chemiczny gatunku S. triloba jest najbardziej zbliżony do profilu chemicznego S. officinalis. Porównując zawartość związków fenolowych stwierdzono, że S. officinalis charakteryzuje się największą sumaryczną powierzchnią rozdzielonych pików. Innymi gatunkami o znaczącej sumarycznej powierzchni pików są: S. lavandulifolia, S. triloba, S. nemorosa, S. jurisicii, S. azurea oraz S. atropatana. Natomiast gatunkami o najmniejszej sumarycznej powierzchni pików okazały się S. sclarea, S. deserta i S. staminea. Z kolei gatunkami o największej zawartości kwasu kawowego są: S. officinalis, S. nemorosa, S. lavandulifolia, S. triloba, S. azurea i S. jurisicii, podczas gdy gatunki S. lavandulifolia, S. jurisicii, S. azurea, S. hians, S. pratensis ssp. Haematodes oraz S. nemorosa wykazały największą zawartość kwasu />-kumarowego. 4. Konstrukcja binarnych fmgerprintów umożliwiła analizę ekstraktów w szerokim spektrum polamości a ponadto wydaje się, że metoda ta jest najlepszym wyborem do konstrukcji charakterystycznych odcisków palca dla badanych gatunków szałwii. 5. Zastosowanie techniki GMD umożliwia analizę złożonych ekstraktów zawierających substancje o szerokim spektrum polamości, gdyż pozwala na porównanie wielu frakcji o odmiennych właściwościach. 6. Technika MGD umożliwia rozdzielenie substancji różniących się polamością, jednakże w przypadku bardzo złożonych próbek ilość całkowicie rozdzielonych plamek jest o wiele mniejsza w porównaniu do ilości uzyskanej przy zastosowaniu techniki GMD. 7. Technika dwukierunkowej chromatografii cienkowarstwowej na chemicznie związanej fazie stacjonarnej typu cyjanowego umożliwia uzyskanie charakterystycznych „fmgerprintów” poszczególnych gatunków szałwii. Problemem jest jednak granica wykrywalności poszczególnych składników próbki, która jest mniejsza w przypadku zastosowania tej techniki. Jest to spowodowane zmniejszającym się stężeniem próbki przypadającym na jednostkę powierzchni adsorbentu w trakcie dwukierunkowego rozwijania. 8. W przypadku wszystkich gatunków szałwii najsilniejszy potencjał anty oksydacyjny wykazał kwas rozmarynowy. Z kolei w przypadku gatunków S. officinalis i S. atropatana silny potencjał anty oksydacyjny wykazał kwas kawowy, natomiast najmniejszą aktywność antyoksydacyjną wykazał ekstrakt S. deserta. 9. Na podstawie porównania binarnych fmgerprintów HPLC-DAD i HPLCELSD stwierdzono, że mimo widocznych różnic sezonowych, dla każdego z badanych gatunków szałwii udało się uzyskać charakterystyczne fingerprinty. 10. Analiza czynników głównych (PCA) umożliwiła wytypowanie spośród dwudziestu badanych próbek, dwóch znacznie różniących się składem chemiczynym, mianowicie S. glutinosa i S. officinalis. Unikalność próbki S. glutinosa można wyjaśnić obecnością intensywnego piku przy czasie retencji (Ir) wynoszącym 18,75 min., natomiast dla próbki S. officinalis jest to obecność piku o stosunkowo dużej intensywności przy czasie retencji wynoszącym 11,92 min. 11. Przeprowadzone eksperymenty wykazały, że procedura spektrofotometrycznego oznaczania zarówno sumy kwasów fenolowych, jak i sumy flawonoidów nie jest doskonała. 12. Zastosowanie fazy stacjonarnej typu Cis podczas analizy ID TLC-MS oraz 2D TLC-LC-MS okazało się najlepszym wyborem adsorbentu dla grupowego rozdziału kwasów fenolowych, selektywnie wyekstrahowanych z S. lavandulifolia oraz do identyfikacji składników tego ekstraktu z użyciem substancji wzorcowych. Ponadto z wyników uzyskanych przy zastosowaniu chromatografii cienkowarstwowej wynika, że ekstrakt S. lavandulifolia zawiera kwas chlorogenowy, którego wcześniej nie zidentyfikowano w tym konkretnym gatunku. Na podstawie fingerprintowania zarówno w normalnym jak i odwróconym układzie faz przy użyciu spektrometrii masowej ekstraktów zawierających związki fenolowe, pokazano, że wstępny rozdział ekstraktów (TLC), a następnie wykorzystanie dwóch wariantów analizy, tj. ID TLC-MS oraz 2D TLC-LC-MS, dostarcza wielu informacji, które mogą być wykorzystane w chemotaksonomi, jak również mogą posłużyć do celów identyfikacyjnych roślin. 13. Analiza spektrofotometryczną 24 ekstraktów różnych gatunków szałwii zebranych w 2009 roku miała na celu międzygatunkowe porównanie procentowej zawartości flawonoidów oraz wyselekcjonowanie spośród badanych gatunków tych o największej zawartości, co bezsprzecznie udało się osiągnąć. Mimo pewnych rozbieżności między wynikami uzyskanymi spektrofotometrycznie a wynikami uzyskanymi techniką HPLC/DAD, chromatogramy pięciu wybranych gatunków szałwii potwierdziły słuszność wyników otrzymanych podczas analizy spektrofotometrycznej. Na podstawie wstępnych wyników, prezentowanych w niniejszej pracy wydaje się, iż wszystkie z czterech wybranych na podstawie analizy spektrofotometrycznej gatunki szałwii, tj. S. pratensis ssp. Haematodes, S. glutinosa, S. staminea oraz S. triloba mogą z powodzeniem konkurować z S. officinalis pod względem właściwości terapeutycznych, szczególnie takich, które są związane ze znaczącą zawartością flawonoidów w materiale roślinnym. 14. Mimo stosunkowo niewielkiej zawartości związków frakcja aglikonów flawonoidowych (AF) wykazuje największe zróżnicowanie wśród badanych gatunków szałwii. Ponadto fmgerprinty frakcji WKF, KKF, ZKF, GFO oraz GFB uzyskane dla gatunku S. triloba wydają się być najbardziej zbliżone do profili chromatograficznych S. officinalis. Analiza czynników głównych (PCA) umożliwiła wytypowanie spośród dziesięciu badanych próbek, dwóch znacznie różniących się składem chemiczynym, mianowicie S. staminea i S. azurea.